Octet® DYKDDDDK バイオセンサー
- クルードおよび精製サンプルの解析における Flag®タグ付きタンパク質に対する高い特異性
- 高いリガンド固相化容量および感度
- 定量のための広いダイナミックレンジ：0.5～100 μg/mL
- 定量の一般的な精度:CV <10%
- バイオセンサーを最大10回まで再利用するための効率的かつ費用対効果の高い再生
概要
Flag-tag®(FLAG®タグまたはDYKDDDDKタグとも表記される)は、天然タンパク質に由来しない合成エピトープ/ペプチドタグです。タンパク質精製、ELISA、フローサイトメトリー、免疫蛍光(IF)、免疫沈降(IP)、ウェスタンブロット法(WB)などのワークフロー全体で、高感度なタンパク質のキャプチャーと検出を可能にします。このオクタペプチドタグは、エンテロキナーゼ切断部位(DDDDK)を内蔵したNH2-DYKDDDDK-COOH(Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Lys)を特徴としており、精製後のタグの正確な除去が可能です。フラグ®タグ付きタンパク質は抗フラッグ® 抗体によって特異的に認識され、タグはトランスフェクションによる組換え発現のためにDNAプラスミド内の目的タンパク質のN末端またはC末端のいずれかにインフレームでクローニングできます。
1988年にHoppらによって導入された1×フラグタグ(1)は、分子量~1012.98 Daの8つのアミノ酸で構成されています。高感度の3×フラグバリアントも広く使用されており、単純なリピートではなく、最適化されたモチーフDYKDHDG-DYKDHDI-DYKDDDDKが一般的に採用されています。抗体ベースの検出、組換えタンパク質の精製、または効率的なアッセイ開発のいずれにおいても、Flag-tag®はクローニングからクリーンアップまで堅牢で汎用性の高い性能を提供します。
Flag® タグは、対応する抗体(2)へのFlag®配列の結合について、約100 nMの解離定数KD で非常に特異的であると見なされます。Octet® DYKDDDDKバイオセンサーは、この短い親水性タグに結合し、タンパク質間相互作用の研究に使用できます。
これらのバイオセンサーは、高い結合容量、感度、そして広いダイナミックレンジを提供します。一貫した正確な測定を維持しながら、カイネティックアッセイや定量アッセイで最大10回再生できます。これにより、リード化合物の同定と最適化、細胞株開発、プロセス開発、クルードおよび精製タンパク質サンプルの両方におけるQCなど、幅広いハイスループットアプリケーションにおいて、コスト効率の高いオプションとなります。
(1) ホップ、T.、プリケット、K.、プライス、V. 他。組換え蛋白質の同定と精製に有用な短いポリペプチドマーカー配列です。 Nat Biotechnol 6, 1204–1210 (1988). https://doi.org/10.1038/nbt1088-1204
(2)アインハウアー、A&;ユングバウアー、A.(2001)。FLAGペプチドに対するモノクローナル抗体M1の親和性クロマトグラフィーのジャーナル。A. 921.25-30. https://doi.org/10.1016/S0021-9673(01)00831-7
注目のリソース
よくあるご質問
FLAG®タグは、組換えタンパク質の非常に特異性の高い抗体ベースのキャプチャーとクリーンな検出が必要な場合、特に収量よりも純度が重要な場合に使用します。
FLAG®タグを使用する主な理由:
- 高純度、低バックグラウンド:抗FLAG® 抗体の親和性は特異性が高く、通常、電荷ベースのHisタグ/IMAC法よりもクリーンな調製物が得られます(1)。これは、汚染物質がHisタグと共浄化されるときに特に有用です。
- メンブレンタンパク質に最適:収量の最大化よりも高純度の達成が重要なメンブレンタンパク質精製に頻繁に推奨されます。
- 迅速で柔軟な精製:FLAG®をN末端またはC末端に融合させ、抗FLAGモノクローナル抗体でアガロースまたは磁気ビーズを捕捉することによって機能します。
- 幅広い検出とアッセイのサポート:同じ抗FLAG®抗体でOctet® BLIアッセイを利用して発現を検出でき、免疫沈降ワークフローに役立ちます。
- 樹脂の実際的な改善: 新しい抗 FLAG® 樹脂は、より手頃な価格で、低い pH 溶出に耐え、使用可能寿命が長いため、再利用性と費用対効果が向上します。
- 注意すべきトレードオフ:FLAG®タグは一般にHisタグよりも収量が低くなりますが、より高い特異性と純度で補われます。
(1) Spriestersbach、Anne & Kubicek、Jan &; Schaefer、Frank &; Block、Helena &; Maertens、Barbara。(2015). Hisタグタンパク質の精製。酵素学における方法559. 1-15.https://doi.org/10.1016/bs.mie.2014.11.003 .
FLAG®タグをタンパク質のN末端またはC末端のいずれかに融合します(最適な端はタンパク質に依存するため、両方をテストします)。精製には、抗FLAG® 抗体結合アガロースまたは磁気ビーズでタグ付きタンパク質をキャプチャーします。FLAG®タグを併用することで、キャプチャーと純度を向上させることができ、純度が収量を上回る膜タンパク質に特に役立ちます。結合、洗浄、溶出についてはベンダーのプロトコルに従います。FLAGペプチドと競合的に溶出するか、または樹脂がそれをサポートする場合は低pHで溶出します。最近の抗FLAG® 樹脂は、より手頃な価格で、低pH溶出に耐え、長持ちします。
Octet® DYKDDDDKバイオセンサーは、抗FLAG®コーティングされており、相互作用測定用のクリーンな配向リガンドとしてFLAGタグタンパク質をキャプチャーします。この抗体ベースのキャプチャーは特異性が高く、エピトープが小さいため活性が維持されることが多いし、低pHでも再生できます。グッドプラクティスでは、非FLAG® タンパク質(陰性対照)やアイソタイプコントロールサーフェスを使用して、非特異的結合を評価します。
FLAGはMerck KGaA, Darmstadt, Germanyの登録商標であり、ANTI-FLAGはSigma-Aldrich Co. LLCの商標です。
