フローサイトメトリーによるハイスループットスクリーニング(HTS)の基礎

フローサイトメトリーは、蛍光を利用して細胞の物理的・生化学的特性を測定する強力な技術です。以下のような特長を備えています。

• ハイスループット：1秒間に最大数万個の粒子を測定可能
• 単一細胞またはビーズの解析：個々の細胞やビーズを個別に測定
• マルチパラメータ測定：1つの細胞から複数のパラメータを同時に解析
• 豊富なデータ量：数百万の細胞に関する情報を収集
   

フローサイトメトリーは、蛍光を用いて、細胞および細胞様粒子の内因性および外因性の物理的・生化学的特性を測定するための、確立され、広く使用されている強力な技術です。個々の細胞の表面、内部、または細胞によって産生される分析物を迅速に計数および測定し、多様な生物学的特性および指標の測定を可能にします。

フローサイトメトリーの基礎：

• 光散乱と蛍光：細胞の特性を測定します。
• 装置：液体中の細胞がチューブ内を一列に進み、レーザーと検出器によって検出されます。
• データ解析：信号はデジタル値に変換され、コンピューターに表示されます。
   

フローサイトメトリー理論：生物学的な細胞または粒子は、光を散乱させる能力を有し、また内因性蛍光を持つ場合があります。フローサイトメトリーは、定性的および定量的測定のためにこれらの特性を利用します。抗体などの蛍光標識マーカーの使用は、単一細胞上の多数の細胞特徴を特定するために活用できます。蛍光とは、あるエンティティが特定の波長の光によって励起され、次いでより高い波長の光を放出する能力のことです。

パラメータ：前方散乱、側方散乱、蛍光などの検出器による測定値を「パラメータ」と呼び、パラメータ値をもつ各検出対象を「イベント」と呼びます。蛍光および散乱シグナルは電気パルスに変換され、パルス高さ、パルス面積、パルス幅などの特性が記録されます。不要なデブリを除外するため、測定開始時にトリガーとしきい値を設定します。ゲイン（電圧）は、検出対象をノイズから識別できるようにするために適用され、シグナルの測定範囲に影響を与えます。初回測定では、各検出器のゲインを調整します。非標識細胞などのネガティブコントロールは、常に含める必要があります。データファイルはFCSファイルと呼ばれ、パラメータの強度や装置設定が保存されます。これらのデータは、ヒストグラムやプロットなどの形式で可視化できます。

蛍光解析では、対数増幅を用いることで、弱いシグナルを拡大し、強いシグナルを圧縮できるため、広い範囲の蛍光強度を表示しやすくなります。一方、リニアスケールは、細胞周期解析など、ダイナミックレンジの狭いシグナルに適しています。

蛍光色素、抗体、蛍光タンパク質など、さまざまなツールが利用可能であり、細胞分取やアポトーシス解析などのさまざまな解析において分子の標識に用いられます。一部の色素は生細胞内に取り込まれますが、他の色素は膜が損傷した細胞にのみ取り込まれるため、生細胞と死細胞を識別できます。

タンデム蛍光色素は、結合した蛍光色素間でエネルギーを移動させることにより、多色解析の能力を高めます。蛍光タンパク質はタンパク質の発現を示し、量子ドットはより狭い蛍光放出ピークを示します。多色蛍光解析により複雑な細胞集団を解析でき、使用可能な蛍光色素の数は、搭載されているレーザーおよび検出器の数に依存します。

標識された対象からの蛍光は、バックグラウンドの検出レベルを設定することで測定されます。蛍光スペクトルの重なりは感度を低下させることがありますが、レーザーを追加することでシグナルの識別性を向上させることができます。コンペンセーションは、コントロールを用いて不要なシグナルを差し引くことにより、蛍光のスペクトル重なりによるシグナルの漏れを補正します。色素染色を最適化することは重要であり、インキュベーション時間や色素と対象の比率などの条件を検討する必要があります。十分な分解能を得るには適切な量の色素が必要であり、シグナル対ノイズ比を最大化するために滴定を行います。

サンプル調製：サンプルは単一細胞懸濁液として調製することが重要です。単一細胞懸濁液は、機械的解離や剥離、酵素溶液の使用、またはカルシウムキレート化によって調製できます。抗体の希釈およびバッファーによる洗浄は、非特異的結合を防ぐために行います。サンプル懸濁液は、一次抗体、二次抗体、ストレプトアビジン、蛍光色素などの試薬とともにインキュベートします。既知量の蛍光色素を含むブランクおよびコントロールサンプルを試験サンプルと併用し、流速や電圧を最適化します。

ビーズ：フローサイトメトリー用ビーズは、品質管理、標準化、および補正を行うために使用される非生物学的なマイクロスフェアです。装置のアライメントのばらつきを低減し、データの正確性、信頼性、および再現性を向上させます。

• 品質管理ビーズは、校正、補正、およびカウントに使用され、装置が規定の性能を満たしていることを確認します。
• 補正ビーズは、多色解析における蛍光シグナルの重なりを最小限に抑えます。特に、自動コンペンセーション機能が利用できない場合に有用です。
• カウントビーズは、ビーズ数と細胞数を比較することで粒子濃度を算出し、正確な細胞数を求めるために使用されます。ビーズは、溶血、染色、および洗浄の後に添加します。既知量の細胞サンプルに一定量のビーズを加え、検出されたイベント数の比から細胞数を算出します。

データ解析：フローサイトメトリーでは、SSC、蛍光、またはFSCの検出器シグナルからパルスピークが生成され、「ドットプロット」として可視化されます。ゲーティングは、細胞サブセットを分離し、死細胞やデブリなどの不要なイベントを除外するための重要な手法です。適切なゲーティングにより、データの精度が向上します。

• ソフトウェア は、電気シグナルを解釈しやすい可視化データへ変換する上で重要な役割を果たし、ドットプロット、ヒストグラム、ヒートマップ、クラスター図などを作成します。ドットプロットでは、フローセルを通過する生体粒子のパルス面積またはパルス高さをグラフ上に表示します。各ドットはフローセルを通過した1つのイベントを表し、1つのグラフ上で数百万の生体粒子を可視化できます。
• ゲーティング：フローサイトメトリー解析は、一般に「ゲーティング」によって行われます。共通した特性をもつ細胞集団（通常は前方散乱、側方散乱、およびマーカー発現）を囲むようにゲートや領域を設定し、目的とする細胞集団を解析・定量します。
• シングレット：2つの生体粒子が互いに付着している場合や、フローセル内を極めて近接して通過した場合には、単一細胞と比較してパルス面積およびパルス幅の両方が大きくなります。シングレットゲートを使用すると、パルス高さは増加せず、パルス面積のみが増加している生体粒子を除外できます。ダブレットイベントは、対象の蛍光強度が実際よりも高く測定される原因となるため、解析から除外することが重要です。

ハイスループットスクリーニング（HTS）は、少量のアッセイ液量で実施できるためコストを抑えることができ、通常は96ウェルまたは384ウェルのマイクロプレートを用いて大量のサンプルをスクリーニングするのに適しています。HTSでは、一般に解析するパラメータ数は少ない一方で、取り扱うサンプル数は大幅に多くなります。

自動化は、以下のようなさまざまな形態で活用されています。

• サンプルおよび試薬の添加、混合、インキュベーション、検出のためにアッセイ用マイクロプレートを搬送するロボットアームを備えた、完全統合型自動化システム
• 無人でのアッセイ解析を支援する、よりシンプルなプレートローディング装置

iQue^® HTSサイトメーターは、マルチパラメトリックな細胞およびビーズ解析と、HTSに適した速度および操作性を組み合わせて提供し、強力な統合ソフトウェアであるiQue Forecyt^®によってサポートされています。iQue^®プラットフォームの主な差別化要因はエアギャップ技術にあり、これによりサンプルの連続的な収集と解析が可能となり、96ウェルプレート全体を最短約5分で処理できます。