迅速なバッファー交換のための透析ろ過
バッファー交換は、ほとんどの高分子精製ワークフローにおいてシンプルながら重要な技術です。不要な物質の除去、サンプル条件の調整、サンプルへのコンポーネントの導入などに使用できます。
たとえば、イオン交換やアフィニティークロマトグラフィーで高分子を効率的にキャプチャーするには、特定のバッファー条件下で実現されます。したがって、クロマトグラフィーの前に、通常はサンプルを最適なローディングバッファーに交換することをお勧めします。
プロのヒント: 浄化済み細胞培養液からHISタグタンパク質を精製しますか?一部の培地組成にはキレート剤が含まれており、アフィニティクロマトグラフィーマトリックスから金属イオンを除去する可能性があります。Sartobind® Lab IDAにサンプルを投入する前に、バッファー交換を使用してこれらの不要な物質を効果的に除去してください。
バッファー交換の一般的なアプリケーション
- 塩分と洗剤の除去
- イオン強度とpHの調整
- 低分子量汚染物質の除去
- 補因子または阻害剤の導入
- 防腐剤の添加
バッファー交換には、透析、ゲルろ過、限外ろ過の3つの方法が一般的です(表1)。ザルトリウスのバッファー交換ソリューションでは、他の方法と比較して柔軟性、速度、そしてバッファー消費量が低いため、方法として限外ろ過が選択されています。
透析 | ゲルろ過 | 限外ろ過 | |
|---|---|---|---|
機器要件 | Low(低) | High(高) | 低-中 |
消耗品 | シングルユース | シングルユースまたは再使用可能 | シングルユースまたは再使用可能 |
サンプルスループット | Low(低) | Low(低) | High(高) |
プロセス時間 | ゆっくり | 高速 | 高速 |
バッファー廃液 | High(高) | 低-中 | Low(低) |
表1:バッファー交換に使用される方法の比較。
バッファー交換法
透析
この方法では、サンプルを透析チューブまたは半透膜で構成されるカセットに入れます。これは交換バッファー(透析液)で囲まれています。試料と透析液の間の濃度勾配により、バッファー成分やその他の低分子量溶質は拡散によってメンブレンを通過します(図1)。
透析には磁気撹拌器と低コストの消耗品のみが必要なため、経済的な技術です。しかし、拡散を原動力とすると、このプロセスが完了するまでに何時間も、場合によっては数日もかかります。サンプル容量は通常0.1〜100mLの範囲であるため、この方法は研究用途にのみ適しています。さらに、使い捨ての消耗品と大量のバッファーの消費は、大量の廃棄物の一因となっています。場合によっては、最終サンプル容量の増加により高分子が希釈され、濃縮ステップが必要になることがあります。
図1:透析は経済的ですが時間のかかるバッファー交換方法です。
ゲルろ過
この技術は、多孔質の樹脂ベースのクロマトグラフィーカラム上でサイズ排除することにより、元のバッファー成分から高分子を分離します。サンプル中の高分子はカラム内を高速に移動しますが、元のバッファーと低分子量溶質は樹脂ビーズの孔に入ると速度が低下します(図2)。
ゲルろ過カラムは、遠心力、重力流、またはFPLCシステム上でのバッファー交換用に、さまざまなフォーマットで入手可能です。このように幅広い取り扱い方法のため、装置のコストは変動しますが、非常に高額になる可能性があります。プロセス時間も変動しますが、特に遠心分離やポンプ駆動の消耗品では透析よりはるかに速いです。研究室では、サンプル容量の点で最も限られた手法であり、容量範囲は約0.1〜10mLです。バイオ医薬品製造のスケールアップは可能ですが、ここでは容量が大きいほど、多くのスペース、時間、バッファーが必要になります。
図2:ゲルろ過により、バッファー交換が高速化されますが、より大きなサンプルの場合は容量が限られています。
透析ろ過
このプロセスでは、バッファーと低分子量成分が半透膜を通過する一方で、フィルターユニット内部に高分子が保持されます。したがって、バッファー交換は、残余液の漸進的な希釈と濃縮によって行われます(図3)。
ゲルろ過と同様に、遠心力、ガス圧、溶剤吸収、またはタンジェンシャルフローろ過(TFF)下での迅速な透析ろ過を可能にするさまざまな設計の限外ろ過が利用可能です。これらに必要な機器は、ほとんどの研究室で一般的に入手可能であり(遠心分離機、圧縮ガス源、または蠕動ポンプのいずれか)、0.1〜500 mL以上の容量があり、最も幅広いプロセス容量に適合します。
図3:透析ろ過により、限外ろ過装置を使用して、事実上すべてのサンプル容量で迅速かつ効率的なバッファー交換が可能になります。
透析ろ過の利点:
- 高速 - 従来>方法と比較して90%の時間を節約できます
- 最大容量 - 最大500 mLの試料容量に対応するシングルステップバッファー交換。
- プラグ&プレイ - 最小限の機器要件で使いやすいソリューション。
- 廃棄物の削減 - 少量の交換で、バッファー消費量を>98%削減できます。
プロのヒント:標的分子が必要な濃度にありますか?高分子は限外ろ過膜で保持できますが、サンプル量は削減されます。Vivaspin® TurboまたはVivaflow® を試して、バッファー交換の前後に高分子の濃度を急速に上げてください。
透析ろ過技術
不連続透析ろ過
これは反復的なプロセスであり、元のバッファーを削除し、続いて交換バッファーを追加します(または その逆)(ビデオ1)。これらのステップを数回繰り返すことで、高度に制御可能なバッファー交換が得られます。これは、塩濃度やpHなどの要素が徐々に調整されるため、分子の安定性を評価する際に特に役立ちます。
ビデオ1:Vivaspin®における不連続透析ろ過
連続透析ろ過
この技術では、元のバッファーが除去されるのと同じ速度で交換バッファーがサンプルに追加されます(ビデオ2)。この単一ステップのプロセスにより、バッファー交換の速度と効率が向上しますが、必要な機器が増大するため、セットアップが複雑になる場合があります。
ビデオ2: Vivaspin® 20 透析ろ過カップによる連続透析ろ過。
限外ろ過と透析ろ過の組み合わせ
Vivaflow®を使用すると、より大きな試料の場合は連続的な透析ろ過も可能です。また、サンプルを濃縮する必要がある場合は、限外ろ過ステップを追加することもできます(ビデオ3)。1つの限外ろ過装置で両方のプロセスを実行することで、サンプルの操作が減り、標的分子の回収率を最大化できます。UF/DFまたはDF/UF。どちらの方法を選択しても、それはウィン/ウィンです。
ビデオ3:限外ろ過とそれに続くVivaflow®による連続透析ろ過。
選択されたバッファー交換リソース
よくあるご質問
透析ろ過によって≥99%のバッファー交換を達成するには、サンプル容量に対して3〜5倍の容量の交換バッファーを使用します。
比較のために、透析では、通常、サンプル量の200〜500倍の交換バッファー(または透析液)をお勧めします。さらに、この方法によるバッファー交換の効率を改善するために、透析液は通常少なくとも一度は交換します。これは、大量のバッファーの無駄につながります。
まずは、透析ろ過などのより効率的なバッファー交換技術を選択します。この方法では、すでに低いレベルのバッファー消費量をさらに抑えることができますが、透析ろ過(いわゆる限外ろ過/透析ろ過(UF/DF)プロセス)を開始する前に、選択したウルトラフィルターを使用してサンプル量を減らすことで、さらに制限できます。
Vivaspin® 20 透析ろ過カップでは、最大 2 mL の試料をウルトラフィルターに加えることができます。容量が20 mLまでのサンプルでは、透析ろ過前に≤2 mLに濃縮する必要があります。
サンプル量が大きい場合、TFFを使用するとプロセス効率が向上する可能性があります。Vivaflow® 透析ろ過貯留装置の容量は500 mLです。バッファーの消費を最小限に抑えるため、この容量より大きいサンプル(最大5,000 mL)を500 mL以下に濃縮してから透析ろ過を行うことをお勧めします。
透析ろ過は、透析などの他の方法に比べて>90%の時間短縮が可能です。幅広い限外ろ過設計により、研究所ですでに利用可能な装置で透析ろ過を行うことができるため、通常、設備への追加投資は不要です。
さらに、透析バッグやゲルろ過カラムと比較してウルトラフィルターの容量が大きいため、サンプル全体に対してバッファー交換を実行でき、ほとんどの場合、サンプルを複数の小さなアリコートで予備濃縮または処理する必要がなくなります。
メンブレンの汚染や分極が時折発生し、処理時間の増加につながります(それでも透析よりはずっと速いです)。しかし、交差流のような技術と高度に最適化された流路を利用しているVivaspin® やVivaflow®などの最新の限外ろ過では、ファウリングや分極化はあまり一般的ではありません。
緩衝液交換用選択製品
Vivaspin® 20 透析ろ過カップ
シングルステップバッファー交換。最大2 mLのサンプル容量では、透析ろ過カップを使えば、簡単で連続的な透析ろ過が可能になります。
