プラスミドDNA（pDNA）
プラスミドDNA（pDNA）は、組換えタンパク質、ウイルスベクター、進化したバイオ治療薬の開発を含む、多くの遺伝子工学研究における重要な出発点となります。遺伝子治療およびDNA/RNAベースの治療薬における継続的な進歩により、臨床アプリケーションに適した信頼性の高いpDNA製造プロセスへの需要が高まっています。
プラスミドは、細菌に天然に存在する環状DNA分子です。細菌のゲノムDNAとは独立して複製する（エピソーム性）プロパティを持つため、遺伝子工学のベクターとして理想的です。精製されたpDNAは、アデノ随伴ウイルス（AAV）やレンチウイルスベクターの製造、mRNA製造時のin vitro転写（IVT）反応、直接遺伝子導入などのプロセスにおける原料として使用できます。
ザルトリウス社は、pDNA製造プロセス全体を通じて効率的な製造を実現する様々なツールを提供しております。以下に、細菌からのプラスミドDNA製造から最終ろ過までのプロセスをご紹介いたします。各工程を確実に導くソリューションをご覧ください。
課題
pDNAの高収量回収は、そのサイズ、シェアストレスを受けやすい特性、および一部のコンタミネーションとの類似性により、困難を伴う場合があります。
- 高密度細胞培養は、そのモニター、維持、およびハーベストがしばしば困難です。
- せん断力はプラスミドDNAにダメージを与え、沈殿したゲノムDNAを分解し、プラスミド抽出物にコンタミネーションをもたらす可能性があります。
- 大型プラスミド（6kb以上）は、従来の樹脂などの方法では、細孔を通過する拡散流量が不十分であるため、精製が困難です。
- pDNA をコンタミネーション（不要なプラスミドアイソフォームを含む）から分離し、均質な製品を得ることは技術的に困難であり、多くの場合、複数のクロマトグラフィー工程が必要となります。
プラスミドDNAの製造プロセス
大腸菌から精製プラスミドまで
目的の遺伝子はプラスミドDNA（pDNA）に挿入され、形質転換と呼ばれるプロセス（通常は電気穿孔法による）で宿主細菌（一般的に大腸菌）に導入されます。宿主細胞は培養過程で増殖し、プラスミドの複製を行うことで目的配列を高収量で生成します。細胞が所定の密度に達すると、細胞のハーベストが行われ、通常アルカリ溶解法によりpDNAが抽出されます。その後、溶解液を清澄化し、クロマトグラフィーを用いてpDNAを精製します。最後に、プラスミドを濃縮・フィルターした後、品質管理措置を実施し、製品の十分な純度を確保します。
宿主細菌を増殖させ、pDNAを何百万コピーも生産します。
プラスミド生産におけるアップストリームのプロセス目的は、宿主細胞集団を用いて可能な限り多くのプラスミドDNA（pDNA）を生成することです。通常、大腸菌（E. coli）が使用されます。これは、大腸菌が急速に増殖し、高収量のpDNAを生産する能力を有しているためです。高生産性クローンが選択され、種培養を形成するために使用されます。この種培養は、生産用バイオリアクターに播種するのに十分な細胞数を提供します。培養後、細胞は通常、遠心分離によって回収されます。
お客様のニーズ：
細胞増殖を最適化し、プラスミドの収量を最大化する、シンプルで信頼性の高いスケーラブルな製造プラットフォーム
- 堅牢で制御可能かつ効率的な製造
- クロスコンタミネーションを防止する無菌性種培養
- 高速フィードするポンプ
ザルトリウスのソリューション：
ザルトリウス社は、あらゆる実製造スケールにおける微生物培養のための幅広いソリューションを提供しております。
Biostat® D-DCUは、10～200リットルの容器サイズを備えたコンパクトなバイオ医薬製造プロセスシステムであり、大腸菌の高密度培養（OD値50以上）の要件を満たします。
- プロセス全体にわたり、細胞増殖条件を最適化する独自の堅牢なフィルム技術を採用
- BioPAT Traceを含む幅広いプロセス分析技術（PAT）の統合
- 迅速なプロセス開発のためのAmbr®から攪拌型培養槽（STR®）までの柔軟性と完全な拡張性
宿主細胞は溶解され、pDNAが放出されます。
細胞溶解の目的は、プラスミドDNAを遊離させるとともに、細胞残渣やゲノムDNAを除去することにあります。宿主細胞のハーベスト後、細胞沈殿物を水酸化ナトリウムソリューションで溶解し、その後酢酸カリウムで中和します。得られた沈殿物には、宿主細胞タンパク質やDNAを含む不純物が含まれています。
プラスミドDNAからの細胞残渣の初期除去
アルカリ性溶解法で回収された原料には、プラスミドDNA（pDNA）に加え、宿主細胞由来のコンタミネーションが含まれております。清澄化工程により、高密度細胞培養物からプラスミドDNAを分離し、細胞残渣や不純物を除去いたします。
お客様のニーズ
高密度細胞溶解液から不純物を分離する最適なpDNA清澄化ソリューション
- ツールは高粘度ソリューションを処理できる必要があります
ザルトリウスのソリューション：
ザルトリウスは、プロセス開発から大規模商用生産までをカバーする幅広いTFF（タンジェンシャルフローろ過）用消耗品を提供しております。当社のグリーンライン中空糸モジュールは、特に高細胞密度環境下における細胞溶解液の清澄化に、完全にスケーラブルなプラットフォームを提供します。中濃度または低濃度の細胞には、Hydrosart® 0.2μmマイクロフィルター膜をお勧めいたします。
- 分子量カットオフ3kD～750kD、孔経0.1μm～0.65μmのメンブレンをラインナップ
- ガンマ線照射済み。シングルユースかつすぐに使用可能のため、装置セットアップに伴う時間とコストを削減
- 高細胞密度培養由来の粘性リサート液に対して特に効果的です
- Sartopore® 2 ファミリーは、あらゆる製品タイプに最適に適応し、最低限のろ過コストを実現する、最も幅広いPES膜の組み合わせを提供します。
- ザルトリウス社は、プロセス開発から大スケール商用生産までをカバーする幅広いTFF（タンジェンシャルフローろ過）システムを提供しております。当社のソリューションでは、シングルユースおよびガンマ線照射済みの流路を用いた機能的に閉鎖系なソリューションの導入が可能です。
サンプルの容量を減らし、バッファーから低分子化合物を除去します。
プラスミドDNA（pDNA）の濃縮、コンタミネーション除去、およびバッファー交換工程は、pDNA製造において不可欠ですが、pDNAの大きな分子量とせん断力に対する感受性により、困難を伴う場合があります。最新の技術革新により、低せん断操作と完全閉鎖系処理を組み合わせ、封じ込めシステム内で最高の回収率を考慮に入れ、理想的な環境を創出しています。
お客様のニーズ：
大型で感度の高い分子向けに調整された濃縮ソリューション
- 分解や回収率の低下を最小限に抑えるため、せん断を制限
- 最大規模の構築体においても最大限の回収を実現
ザルトリウスのソリューション：
ザルトリウスは、生体分子の濃縮／バッファー交換・透析ろ過に適した強力な製品ポートフォリオを提供しております。当社のグリーンライン中空糸型シングルユースフローアッセンブリは、pDNAの濃縮に完全なスケーラビリティを備えたシステムを実現します。
- 大型プラスミド（最大750 kb）のろ過をサポートするサイズバリエーションをご用意しております。研究用途では30 kDから750 kDの分子量カットオフ（MWCO）が推奨されます。
- ガンマ線照射済みですぐに使用可能のため、プロセス時間を短縮できます。
- 低せん断オペレーションを実現します。
プラスミドDNAの分離
pDNAはバイオ医薬品として、純度、有効性、収量に関して厳格な要件が課せられております。pDNAの捕捉はダウンストリームプロセスにおける重要な工程であり、pDNAを濃縮しながらほとんどのコンタミネーションを除去いたします。
お客様のニーズ：
pDNA捕捉プロセスは、高感度で低せん断、かつ高分子に適したものです。
- 不純物を効率的かつ穏やかに除去し、分解を回避します。
- サイズ制限のない捕捉方法
ザルトリウスのソリューション：
HIP²プラスミドプロセスパック™ は、ザルトリウスの専門家チームが開発したpDNA精製のためのエンドツーエンドソリューションです。
CIMmultus® DEAEカラムは、pDNAを効果的に精製するための当社のプラグアンドプレイプラットフォームにおける第一工程となります。
- pDNAを濃縮し、宿主細胞タンパク質やその他の核酸の大部分を除去します。
- pDNAに対する高い動的結合容量を実現します。
- 低せん断力によりpDNA回収率を最大化します。
- 詳細かつ簡潔なプロトコルにより、堅牢なプロセスの開発をサポートいたします。
- アレグロ シングルユース クロマトグラフィー システムは、パイロット生産、臨床生産、商用生産向けに設計されております。柔軟なモジュラー設計により、等度法またはグラジエント法のセットアップオプションでカラムおよびメンブレンのオペレーションが可能です。
プラスミド異形体の分離による均質なプラスミドDNAの調製
pDNAの異形体を分離するには、追加の研磨クロマトグラフィー工程が必要となります。通常、スーパーコイル（SC）pDNAをオープンサーキュラー（OC）および線状DNAから分離するために実施されます。医薬品用pDNAには、純度、均質性、有効性に関して厳格な要件が課せられており、SC pDNAが最も安定性が高く、効率的かつ生物学的活性に優れた形態です。
お客様のニーズ：
均質なプラスミドDNA抽出物を確実に生成する、効率的で堅牢な研磨クロマトグラフィーソリューション
- 方法は、プラスミドの異形体を分離するのに十分な感度を有している必要があります
ザルトリウスのソリューション：
ザルトリウスのHIP²プラスミドプロセスパック™ は、包括的なプラスミドDNA精製ソリューションです。
CIMmultus® C4 HLDカラムは、HIP²プラスミドプロセスパック™の第二工程を構成します。
- スーパーコイル型（SC）pDNAから、オープンサーキュラー型（OC）およびリニア型pDNAアイソフォームを分離します
- 高い動的結合容量と低せん断により、pDNAの回収率を最大化します
- 柔軟性とスケーラビリティを提供します
- アレグロ シングルユース クロマトグラフィー システム は、パイロット生産、臨床生産、商用生産向けに設計されております。柔軟なモジュラー設計により、等度法またはグラジエント法のセットアップオプションでカラムおよびメンブレンのオペレーションが可能です。
サンプルの容量を減らし、バッファーから低分子化合物を除去します。
プラスミドDNA（pDNA）の濃縮、コンタミネーション除去、およびバッファー交換工程は、pDNA製造において不可欠ですが、pDNAの大きな分子量とシェアストレスを受けやすい特性により、困難を伴う場合があります。最新の技術革新により、低せん断操作と完全閉鎖系プロセスを組み合わせ、封じ込めシステム内で最高の回収率を実現し、pDNA製造に理想的な環境を創出しています。
お客様のニーズ：
大型で感度の高い分子向けに調整された濃縮ソリューション
- 分解や回収率の低下を最小限に抑えるため、せん断を制限
- 最大規模の構築体においても最大限の回収を実現
ザルトリウスのソリューション：
ザルトリウスは、生体分子の濃縮／バッファー交換・透析ろ過に適した強力な製品ポートフォリオを提供しております。当社のグリーンライン中空糸型シングルユースフローアッセンブリは、pDNAの濃縮に完全なスケーラビリティを備えたシステムを実現します。
- 大型プラスミド（最大750 kb）のろ過をサポートするサイズバリエーションをご用意しております。研究用途では30 kDから750 kDの分子量カットオフ（MWCO）が推奨されます。
- ガンマ線照射済みですぐに使用可能のため、プロセス時間を短縮できます。
- 低せん断オペレーションを実現します。
単離したプラスミドDNAは、微生物コンタミネーションを防ぐためろ過滅菌を施します。
最終滅菌ろ過工程は、微生物汚染を防止し、患者様への安全を確保する上で極めて重要です。革新的なリスク軽減戦略により、最終ろ過工程からシングルユースバッグへの保管に至るまでの全工程の完全性が守られます。
お客様のニーズ
ろ過滅菌ソリューション（大型でシェアストレスを受けやすいプラスミドDNA分子へのアプリケーション）
- 粘性のあるソリューションに適しています
ザルトリウスのソリューション：
ザルトリウスは、お客様のアプリケーションに最適な進化したろ過滅菌フィルターをご提供いたします。Sartopore® 2シリーズ は、最も幅広いPES膜の組み合わせを揃えており、あらゆる種類の製品に完璧に適応し、最低限のろ過コストを実現します。
- 最終フィルターの孔経は0.2ミクロンまたは0.45ミクロンからお選びいただけます
- 閉鎖系シングルユースアプリケーション向けにフィルタートランスファーセットに統合されています
- Sartopore® プラチナ は、最終充填アプリケーションに最適な選択肢です。ポリエステル系（PES）膜の独自の表面改質により、吸着が最小限に抑えられ、高い製品収率と確実な濡れ性を実現し、信頼性の高い完全性試験を可能にします。
- Sartocheck® 5 は、滅菌用グレードフィルターの完全性試験における基準です。本装置は、業界をリードする直感的なデータセキュリティと完全性を提供するとともに、試験における最高水準の定量的リスク管理（QRM）基準を満たすよう設計されています。
pDNA精製プロセス全体において、不純物の有無を判定し、製品の定量を行うためには分析が不可欠です。提供される情報は、プロセスの制御、堅牢性、そして高品質な製品の実現をサポートします。
お客様のニーズ
pDNAサンプルの包括的な評価をプロバイダーする分析ソリューション
- 最終製品の全体像を迅速に提供
- 手間のかかる手法を回避します
ザルトリウスのソリューション：
ザルトリウスは、プラスミドDNAサンプルのモニターおよび制御のための包括的なソリューションをご提供いたします。
当社のCIMac™ pDNA 0.3 mL分析用カラムは、プラスミドDNAの迅速かつ再現性のあるHPLCモニターおよび定量、ならびに異なるプラスミドDNAアイソフォームの分離を目的としております。
- 主に精製プロセスの各段階におけるpDNAサンプルの工程内制御および最終制御用に設計されていますが、
- RNAの存在判定にもご利用いただけます。
- 迅速かつ高分離能な解析を実現します。
- フローに依存しない分離
- 高い感度と再現性のある
- PATfix™HPLCシステムは、HPLCフィンガープリンティング技術を用いた不純物および重要品質コンポーネントの制御のための「製造ライン上」解析を実現します。
CIMmultus® HiP2 プラスミドプロセスパック™
CIMmultus® HiP2 プラスミド プロセスパック™
科学者の皆様が独自のプラスミドDNA精製プロセスを開発し、製造段階へ技術移管されることを支援するため、すぐに使用可能なプラスミドDNA精製パックを開発いたしました。HiP2プラットフォームは、わずか2工程のクロマトグラフィー（陰イオン交換クロマトグラフィーに続いて疎水性相互作用クロマトグラフィー）で、プラスミドDNAを効率的に回収することを可能にします。
- 効率的 - コンタミネーション（RNA、ゲノムDNA、宿主細胞タンパク質、エンドトキシン）の大部分を除去し、スーパーコイル型pDNAを分離します
- 迅速性 - 処理はわずか数時間で完了し、生産性を向上させ製造コストを最小限に抑えます。明確に定義されたプロトコルにより、堅牢な精製手順を迅速に確立できます。
- スケーラブル - モノリスカラムの特異的プロパティにより、小規模な実験室レベルから大スケールの工業的pDNA精製まで、生産レベル間のシームレスな技術移管を可能にします。
プラスミドDNAのダウンストリームプロセスにおける生産性向上
pDNA精製におけるモノリスの研磨クロマトグラフィーの性能について詳しくご覧ください
純度
あらゆる不純物を完全に除去することで、高純度かつ均質なプラスミドDNAサンプルが得られ、アイソフォームの分離も含まれます。
生産性
大規模なプラスミドであっても、回収率や処理容量を損なうことなく、迅速なプロセスを実現します。
プラグアンドプレイ
ツールボックスには、すぐに使用可能な2つのカラムと、プロセスへの迅速かつ容易な組み込みのための詳細なプロトコルが含まれています。
CIMmultus® HiP2プラスミドプロセスパック™に含まれる製品
CIMmultus® DEAE
陰イオン交換クロマトグラフィー
弱塩基性陰イオン交換クロマトグラフィーを用いることで、CIMmultus® ジエチルアミン（DEAE）はプラスミドDNA（pDNA）を濃縮し、宿主細胞タンパク質、mRNA、およびゲノムDNAの大部分のコンタミネーションを除去します。
二工程プラスミドプロセスパックにおける初期捕捉を実行します
他の精製法から得られた清澄化ライセートまたは部分精製プラスミドのプロセスにご利用いただけます
pDNA分子に対して高結合能を有し、単一ピークに濃縮されます
ほとんどの不純物は結合しません（RNAは例外で、NaClを初めて増加させた後に溶出する）
pDNAのサイズは制限要因となりません
11 kbを超えるpDNAについては、6μmチャネルの使用をお勧めいたします
どのように機能するのでしょうか？
CIMmultus® DEAEに適用したpDNA抽出物のクロマトグラムです。pDNAはRNAやその他のコンタミネーションから効率的に分離されます。
CIMmultus® C4 HLD
疎水性相互作用クロマトグラフィー
CIMmultus® C4 高リガンド密度（HLD）ブチル修飾モノリスカラムは、残存ゲノムDNA、エンドトキシン、および開放環状（OC）および線状pDNA異形体を除去し、スーパーコイル（SC）pDNAを分離します。
- 二段階プラスミドプロセスパックにおける研磨工程を実行します
- 高塩濃縮下でのpDNA結合促進
- 残存する非DNAコンタミネーション物質を除去します
- スーパーコイル型pDNAと他の異形体の分離を促進します
- pDNA精製は、結合・溶出するモードとサンプル置換モードの両方で実施可能です
どのように機能するのでしょうか？
CIMmultus® C4 HLDに適用した捕捉pDNAのクロマトグラムです。残留コンタミネーションは除去され、SC pDNAがOC pDNAから効率的に分離されます。
