プラスミドDNA（pDNA）
プラスミドDNA（pDNA）は、組み換えタンパク質、ウイルスベクター、先進的なバイオ医薬品の開発など、多くの遺伝子工学研究における重要な出発点となります。
遺伝子治療およびDNA | RNAベースの治療薬分野における継続的な進歩により、臨床用途に適した、信頼性の高いpDNA製造プロセスへの需要が高まっています。プラスミドは、細菌に自然に存在する環状DNA分子です。
細菌のゲノムDNAとは独立して（エピソームとして）複製されるという特性を持ち、遺伝子工学用ベクターとして理想的です。精製されたpDNAは、アデノ随伴ウイルス（AAV）やレンチウイルスベクターの製造、mRNA製造におけるin vitro転写（IVT）反応、直接遺伝子導入などのプロセスにおいて、原材料として使用されます。
ザルトリウスは、pDNA製造プロセス全体を通じて、効率的な製造を実現するための多様なツールを提供しています。
以下では、細菌から最終ろ過に至るまでのプラスミドDNA製造プロセスを紹介し、各工程を確実に導くソリューションをご覧いただけます。
課題
pDNAはサイズが大きく、シェアストレスを受けやすい特性を持ち、さらに一部の夾雑物と類似しているため、高収率での回収は困難となる場合があります。
- 高密度細胞培養は、モニタリング、維持、ハーベストが困難なケースが少なくありません。
- せん断力はpDNAにダメージを与え、沈殿したゲノムDNAを分解することで、プラスミド抽出物にコンタミネーションをもたらす可能性があります。
- 6 kbを超える大型プラスミドは、従来の樹脂などの方法では、細孔をうまく通過して拡散できないため、精製が困難です。
- 不要なプラスミドアイソフォームを含む夾雑物からpDNAを分離し、均質な生成物を得ることは技術的に困難であり、多くの場合、複数のクロマトグラフィー工程が必要となります。
プラスミドDNAの製造プロセス
大腸菌から精製プラスミドまで
目的の遺伝子はプラスミドDNA（pDNA）に挿入され、形質転換と呼ばれるプロセス（通常はエレクトロポレーション）によって宿主細菌（一般的に大腸菌）に導入されます。
宿主細胞は培養工程中に複製を行い、プラスミドおよび目的配列を大量に産生します。細胞が所定の密度に達するとハーベストされ、通常はアルカリ溶解法によりpDNAが抽出されます。その後、溶解液を清澄化し、クロマトグラフィーを用いてpDNAを精製します。
最終的にプラスミドは濃縮およびろ過され、製品の純度が十分であることを確認するための品質管理試験が実施されます。
宿主細菌を増殖させ、pDNAを数百万コピー産生
プラスミド製造におけるアップストリーム工程の目的は、宿主細胞集団を用いて可能な限り多くのプラスミドDNA（pDNA）を生産することです。一般的には、大腸菌（E. coli）が用いられます。これは、大腸菌が迅速に増殖し、高収量のpDNAを産生できるためです。
まず、高生産性のクローンを選抜し、シードトレインを構築します。これにより、製造用バイオリアクターへの接種に必要な十分な細胞数を確保します。培養後、細胞は通常、遠心分離によって回収されます。
ニーズ
細胞増殖を最適化し、プラスミド収量を最大化する、シンプルで信頼性の高いスケーラブルな製造プラットフォームです。
- 堅牢で制御性が高く、効率的な製造
- クロスコンタミネーションを防止する無菌シードトレイン
- 高速フィードポンプ
ソリューション
ザルトリウスは、あらゆる実製造スケールに対応する微生物培養向けソリューションを提供しています。
Biostat® D-DCUは、10～200 Lの容器サイズを備えたコンパクトなバイオ医薬品製造プロセスシステムで、大腸菌の高密度培養（OD＞50）の要件に対応します。
- プロセス全体にわたり、細胞増殖条件を最適化する独自で堅牢なフィルムを採用
- BioPAT Traceを含む幅広いプロセス分析技術（PAT）の統合
- 迅速なプロセス開発のため、Ambr®から攪拌型培養槽リアクター（STR）までの柔軟性と完全なスケーラビリティ
- Mycap® CCXは、フラスコを開けたりバイオセーフティキャビネットに入ったりすることなく、細胞の増殖および継代が可能な細胞培養増殖システムです。
- Ambr® 250 は、微生物培養用に変更可能なシングルユース多連型バイオリアクターで、プロセス開発の加速に貢献します。
- グリーンラインシリーズのシングルユース中空糸カートリッジは、高密度培養からの細胞ハーベストをサポートします。
宿主細胞を溶解し、pDNAを放出
細胞溶解の目的は、pDNAを放出するとともに、細胞残渣およびゲノムDNAを除去することです。宿主細胞をハーベストした後、細胞ペレットを水酸化ナトリウム溶液で溶解し、その後、酢酸カリウムで中和します。その結果得られる沈殿物には、宿主細胞由来タンパク質やDNAなどの不純物が含まれます。
pDNAからの細胞残渣の初期除去
アルカリ細胞溶解工程で得られる溶解液には、pDNAに加えて、宿主細胞由来の夾雑物が含まれています。清澄化工程では、高密度培養由来の溶解液からpDNAを精製し、細胞残渣および不純物を除去します。
ニーズ
高密度培養溶解液からでも不純物を分離できる、最適なpDNA清澄化ソリューションが求められます。
- 高粘度の溶液を処理可能なツールであること
ソリューション
ザルトリウスは、プロセス開発から大規模商用生産までをカバーする、幅広いタンジェンシャルフローろ過（TFF）消耗品を提供しています。
グリーンラインシリーズの中空糸モジュールは、特に高細胞密度条件下において、細胞溶解液の清澄化に対応する完全にスケーラブルなプラットフォームを提供します。中程度または低濃度の細胞には、Hydrosart® 0.2 µm精密ろ過フィルターメンブレンが推奨されます。
- 分子量カットオフ3 kDa～750 kDa、孔径0.1 µm～0.65 µmのメンブレンのポートフォリオ
- ガンマ線滅菌済みのシングルユース仕様による、すぐに使用可能であること、および装置セットアップに伴う時間とコストの削減
- 高細胞密度培養由来の高粘度溶解液に対する高い有効性
- Sartopore® 2 ファミリーは、あらゆる製品タイプに適応し、ろ過コストの最小化を実現する、最も幅広いPESメンブレンの組み合わせを提供します。
- ザルトリウスは、プロセス開発から大規模な商用生産までの用途をカバーする、幅広いTFF（タンジェンシャルフローろ過）システムを提供しています。ザルトリウスのソリューションでは、シングルユースおよびガンマ線照射済みの流路を用いた、機能的に閉鎖されたソリューションを導入することが可能です。
試料の容量を減らし、バッファーから低分子化合物を除去
pDNAの濃縮、夾雑物の除去、およびバッファー交換工程はpDNA製造に不可欠ですが、pDNAは分子サイズが大きくシェアストレスを受けやすいため、困難を伴う場合があります。
最新の技術革新では、低せん断操作と完全閉鎖系プロセス処理を組み合わせることで、封じ込められたシステム内で高い回収率を実現し、pDNA製造に理想的な環境を提供します。
ニーズ
大型でデリケートな分子向けに調整された濃縮ソリューションです。
- 分解や回収率低下を最小限に抑えるためのせん断低減
- 大型コンストラクトであっても最大限の回収率
ソリューション
ザルトリウスは、バイオ分子の濃縮｜バッファー交換・透析に適した、強力な製品ポートフォリオを提供しています。
グリーンラインシリーズの中空糸シングルユースフローアッセンブリーは、pDNA濃縮に対応する完全にスケーラブルなシステムを実現します。
- 大型プラスミド（最大750 kb）のろ過に対応する幅広いサイズのポートフォリオ（推奨MWCO：30 kDa～750 kDa）
- ガンマ線照射済み・Ready-to-Use仕様によるプロセス時間の短縮
- 低せん断条件での運転
pDNAの分離
pDNAはバイオ医薬品として、純度、有効性、収量に関して厳格な要件が求められます。pDNAキャプチャーはダウンストリームプロセスにおける重要な工程であり、pDNAを濃縮しながら、主要な夾雑物を除去します。
ニーズ
高感度で、低せん断かつ高分子に適したpDNAキャプチャープロセスです。
- 分解を防ぐための、不純物の効率的かつ穏やかな除去
- サイズ制限のないキャプチャー手法
ソリューション
HIP² Plasmid Process Pack™ は、ザルトリウスの専門家チームによって開発された、pDNA精製のためのエンドツーエンドソリューションです。
CIMmultus® DEAEカラムは、pDNAを効果的に精製するためのプラグアンドプレイ型プラットフォームにおける最初のステップを担います。
- pDNAを濃縮し、宿主細胞由来タンパク質およびその他の核酸の大部分を除去
- pDNAに対する高い動的結合容量
- 低せん断力によるpDNA回収率の最大化
- 詳細でシンプルなプロトコルによる、堅牢なプロセス開発のサポート
Allegroシングルユースクロマトグラフィーシステムは、パイロット生産、臨床生産、および商用生産向けに設計されています。柔軟なモジュラー設計により、アイソクラティックまたはグラジエントのセットアップオプションで、カラムおよびメンブレンの操作が可能です。
プラスミドアイソフォームを分離し、均質なpDNAを生成
pDNAアイソフォームを分離するためには、追加のポリッシングクロマトグラフィー工程が必要であり、通常はスーパーコイル型（SC）pDNAを、オープンサーキュラー（OC）およびリニアDNAから分離します。
医薬品用pDNAは、純度、均一性、有効性に関して厳格な要件が課されており、SC pDNAは最も安定で、効率的かつ生物学的活性に優れた形態です。
ニーズ
均質なpDNA抽出物を安定して生成する、効率的かつ堅牢なポリッシングクロマトグラフィーソリューションです。
- プラスミドアイソフォームを分離するのに十分な感度を有する手法
ソリューション
ザルトリウスのHIP² Plasmid Process Pack™は、包括的なpDNA精製ソリューションです。
CIMmultus® C4 HLDカラムは、HIP² Plasmid Process Pack™における第2工程を構成します。
- スーパーコイル型（SC）pDNAから、オープンサーキュラー（OC）およびリニアpDNAのアイソフォームを分離
- 高い動的結合容量と低せん断による、pDNA回収率の最大化
- 柔軟性とスケーラビリティの提供
- Allegroシングルユースクロマトグラフィーシステムは、パイロット生産、臨床生産、および商用生産向けに設計されています。柔軟なモジュラー設計により、アイソクラティックまたはグラジエントのセットアップオプションで、カラムおよびメンブレンの操作が可能です。
試料の容量を減らし、バッファーから低分子化合物を除去
pDNAの濃縮、夾雑物の除去、およびバッファー交換工程はpDNA製造に不可欠ですが、pDNAは分子サイズが大きくシェアストレスを受けやすいため、困難を伴う場合があります。
最新の技術革新では、低せん断操作と完全閉鎖系プロセス処理を組み合わせることで、封じ込められたシステム内で高い回収率を実現し、pDNA製造に理想的な環境を提供します。
ニーズ
大型でデリケートな分子向けに調整された濃縮ソリューションです。
- 分解や回収率低下を最小限に抑えるためのせん断低減
- 大型コンストラクトであっても最大限の回収率
ソリューション
ザルトリウスは、バイオ分子の濃縮｜バッファー交換・透析に適した、強力な製品ポートフォリオを提供しています。
グリーンラインシリーズの中空糸シングルユースフローアッセンブリーは、pDNA濃縮に対応する完全にスケーラブルなシステムを実現します。
- 大型プラスミド（最大750 kb）のろ過に対応する幅広いサイズのポートフォリオ（推奨MWCO：30 kDa～750 kDa）
- ガンマ線照射済み・Ready-to-Use仕様によるプロセス時間の短縮
- 低せん断条件での運転
分離したpDNAに無菌ろ過を行い、微生物コンタミネーションを防止
最終滅菌ろ過工程は、微生物コンタミネーションを防止し、患者様の安全性を確保するために極めて重要です。
革新的なリスク低減戦略により、最終滅菌ろ過工程からシングルユースバッグでの保管に至るまで、全工程にわたるオペレーションの完全性が確保されます。
ニーズ
大型でシェアストレスを受けやすいpDNA分子に適用可能なろ過滅菌ソリューションです。
- 粘性のある溶液に適したろ過性能
ソリューション
ザルトリウスは、お客様のアプリケーションに適した、最先端の無菌ろ過フィルターを提供しています。Sartopore® 2ファミリー は、あらゆる製品タイプに適応し、ろ過コストの最小化を実現する、最も幅広いPESメンブレンの組み合わせを提供します。
- 孔経0.2 µmまたは0.45 µmの最終フィルターに対応
- 閉鎖系シングルユースアプリケーション向けフィルタートランスファーセットへの統合
- Sartopore® Platinum は、最最終充填アプリケーションに最適な選択肢です。PESメンブレンの独自の表面改質により、吸着を最小限に抑えつつ高い製品収量を実現し、確実な濡れ性を確保することで、信頼性の高い完全性試験を可能にします。
- Sartocheck® 5 は、滅菌グレードフィルターの完全性試験における基準です。この装置は、業界をリードする直感的なデータセキュリティと完全性を提供するとともに、試験における最高水準の品質リスクマネジメント（QRM）基準を満たすよう設計されています。
pDNA精製プロセス全体を通じて、不純物の有無を判定し、製品の定量を行うためには、分析が不可欠です。得られる情報は、プロセス管理、堅牢性の確保、高品質な製品の実現を支援します。
ニーズ
pDNAサンプルを包括的に評価できるアナリティクスソリューションです。
- 最終製品の全体像を迅速に把握できること
- 労力のかかる手法の回避
ソリューション
ザルトリウスは、pDNAサンプルのモニタリングおよび制御のための包括的なソリューションを提供しています。
CIMac™ pDNA 0.3 mL分析用カラムは、プラスミドDNAの迅速かつ再現性の高いHPLCモニタリングおよび定量、ならびに異なるプラスミドDNAアイソフォームの分離を目的としています。
- 精製プロセスの各段階におけるpDNAサンプルのプロセス内制御および最終制御向けに設計
- RNAの有無判定にも使用可能
- 迅速で高分離能の解析
- 流速非依存性の分離
- 高い感度と再現性
- PATfix™HPLCシステムは、HPLCフィンガープリンティングを用いて、不純物および重要品質特性の管理のための「アットライン」解析を提供します。
CIMmultus® HIP² Plasmid Process Pack™
CIMmultus® HIP² Plasmid Process Pack™
研究者が独自のプラスミドDNA（pDNA）精製プロセスを開発し、製造工程へ移管できるよう支援するため、すぐに使用可能なpDNA精製パックを開発しました。
HiP²プラットフォームは、2段階のクロマトグラフィー工程（陰イオン交換クロマトグラフィーに続く疎水性相互作用クロマトグラフィー）により、pDNAを効率的に回収することを可能にします。
- 高効率：夾雑物（RNA、ゲノムDNA、宿主細胞タンパク質、エンドトキシン）の大部分を除去し、スーパーコイル型pDNAを分離
- 迅速：わずか数時間で完了する処理による生産性向上と製造コスト削減、および明確に定義されたプロトコルによる堅牢な精製手順の迅速な確立
- スケーラブル：モノリスカラムの独自の特性による、小規模な研究室レベルから大規模な工業スケールでのpDNA精製までのシームレスなスケール移行
プラスミドDNAのダウンストリームプロセスの生産性向上
プラスミドDNA（pDNA）精製におけるポリッシングクロマトグラフィーで、モノリスがどのように機能するかについてご紹介します。
純度
あらゆる不純物を高いレベルで除去することで、アイソフォーム分離を含む、高純度で均質なpDNAサンプルを得ることができます。
生産性
大型プラスミドであっても、回収率や処理容量を損なうことなく、迅速な処理を実現します。
プラグアンドプレイ
ツールボックスには、すぐに使用可能な2つのカラムと、プロセスへの迅速かつ容易な組み込みを可能にする詳細なプロトコルが含まれています。
CIMmultus® HIP² Plasmid Process Pack™に含まれる製品
CIMmultus® DEAE
陰イオン交換クロマトグラフィー
弱塩基性の陰イオン交換クロマトグラフィーを用いることで、CIMmultus® ジエチルアミン（DEAE）はpDNAを濃縮し、宿主細胞タンパク質、mRNA、およびゲノムDNAといった夾雑物の大部分を除去します。
- 2工程からなるプラスミドプロセスパックにおける初期キャプチャー工程
- 清澄化溶解液、または他の精製法から得られた部分精製プラスミドの処理に使用可能
- pDNA分子に対する高い結合容量により、単一ピークへの濃縮が可能
- ほとんどの不純物は結合せず（RNAを除き、NaCl濃度の最初の上昇後に溶出）
- pDNAサイズは制限要因とならない
- 11 kbを超えるpDNAについては、6 µmチャネルの使用を推奨
pDNAを効率的に分離する仕組み
CIMmultus® DEAEに適用したpDNA抽出物のクロマトグラムです。pDNAがRNAおよびその他の夾雑物から効率的に単離される様子を示しています。
CIMmultus® C4 HLD
疎水性相互作用クロマトグラフィー
CIMmultus® C4高リガンド密度（HLD）ブチル修飾モノリスカラムは、残存するゲノムDNA、エンドトキシン、オープンサーキュラー（OC）型およびリニア型pDNAを除去し、スーパーコイル型（SC）pDNAを単離します。
- 2段階プラスミド精製プロセスにおけるポリッシング工程を担うソリューション
- 高塩濃度条件下で促進されるpDNA結合
- 残存する非DNA系夾雑物の除去
- スーパーコイル型pDNAと他のアイソフォームとの分離
- 結合 | 溶出モードおよびサンプル置換モードの両方に対応したpDNA精製
pDNAを効率的に分離する仕組み
CIMmultus® C4 HLDに適用したキャプチャー工程後のpDNAのクロマトグラムです。残存する夾雑物が除去され、SC pDNAがOC pDNAから効率的に分離されることを示しています。
