遺伝的安定性試験
遺伝子安定性解析：特性解析と安定性試験
遺伝子安定性は、バイオ医薬品の製造に使用される細胞の特定の特性解析です。遺伝子組み換え細胞には、目的のタンパク質をコーディングするトランスジーン挿入配列が含まれています。トランスジーンは変異を起こす可能性があり、製品の品質やプロセスの適切な実行に影響を与える恐れがあります。
ICHガイドラインでは、正しいタンパク質のプロダクションを安定的に確保するため、挿入配列の安定性と完全性を特性解析する必要があると規定されています。これは、細胞株および生産システムが許容可能であることを保証するための必須工程の一つに過ぎません。
細胞株の遺伝的安定性を判定する手法は複数存在します。これらの試験は、生産用細胞株の特性解析時、ならびにマスターセルバンクおよび生産終了時セルバンクの遺伝的安定性を評価する際に実施されます。試験は他の時期にも実施可能ですが、特に培養プロセスに変更が生じる段階において有用です。
ザルトリウスでは、以下の遺伝的安定性アッセイを提供しており、お客様の製品に最適なアプローチについてアドバイザーとしてご提案いたします：
細胞株アイデンティティー試験（DNAバーコーディング、RAPD）
遺伝子コピー数
トランスジーンの配列
サザンブロット法
ザルトリウスチームは、お客様のアプリケーションに最適なアッセイ法を選定するため、規制に関するご説明をさせていただきます。
弊社の専門家が、プラットフォーム手法を用いた製品安定性試験のためのカスタム遺伝子配列解析アッセイの開発をお手伝いいたします。
当社の現行GMP準拠アッセイは、欧州薬局方（EP）および米国薬局方（USP）のガイドラインに準拠しております。
ザルトリウス社の遺伝子安定性解析ソリューション
| 目的 |
|---|---|
DNAバーコーディングアッセイ | 少数の遺伝子領域の情報を用いて、このバーコーディングにより種レベルの細胞株のアイデンティティーを確認することが可能です。 |
ランダム増幅ポリモーフィックDNA解析（RAPD） | RAPD は変異やコンタミネーションを識別し、通常、研究用、マスター、作業用、製造終了時のセルバンクを比較するために使用されます。 |
遺伝子コピー数 | 組換えセルバンクに対して実施され、細胞あたりのトランスジェンコピー数を確認します。 |
ABI 3500プラットフォームを用いたサンガー配列 | 目的のタンパク質を産生するために使用されるトランスジーンの核酸配列およびその隣接領域に基づいて、細胞株の安定性を確認します。 |
サザンブロット解析 | サザンブロット法により、製造細胞のDNA消化産物中にトランスジーンが存在することを確認し、その完全性を実証します。 |
ザルトリウス社では、細胞株のアイデンティティーを確認する2つの方法を提供しております：
- DNAバーコーディングアッセイ
- ランダム増幅多型DNA解析（RAPD）
細胞株アイデンティティー同定のためのDNAバーコーディングアッセイ
ザルトリウスは、現行GMP細胞株特性解析試験向けにDNAバーコーディングを提供しております。本法により、ICHおよびCBER/FDAの規制ガイドラインに基づき、哺乳類由来細胞株の種レベルでのアイデンティティーを判定することが可能です。規制当局により既に認知され信頼されている実績ある手法であるDNAバーコーディングは、現在、種判定における推奨手法とされております。
ザルトリウスのDNAバーコーディングアッセイは、以下の細胞株についてバリデートされたです：HeLa、HEK-293、MRC-5、CHO-K1、Vero、A9、MA104、MDBK。
ランダム増幅多型DNA解析（RAPD）
DNAバーコードアッセイに代わる細胞株のアイデンティティー試験方法として、ランダム増幅多型DNA解析（RAPD）がございます。この手順では、6種類の異なるプライマーセットを用いて、対象ゲノムの領域を増幅いたします。
専門家にご相談ください
目的のタンパク質を生産するために使用されるトランスジーンの核酸配列を決定することは、細胞株の遺伝的安定性を確認するために実施される重要な試験の一つです。
組換えタンパク質医薬品の開発初期段階では、マスターセルバンク（MCB）および製造終了時セルバンク（EOP）の両方について、トランスジーンのメッセンジャーRNA（mRNA）配列が決定されます。これにより、遺伝暗号に変化がなく、細胞が重大な変化を経験していないことを裏付ける証拠が明らかになります。
さらに、コーディング領域に加え、トランスジーンの隣接領域も生産性や発現レベルに影響を及ぼす可能性があるため、重要な検討事項となります。隣接領域の配列決定（DNAレベル）はICHガイドラインで推奨されており、第3相臨床試験前に検討すべき事項です。
ザルトリウス社では、ABI 3500プラットフォームを用いた従来のサンガー法による配列を提供しております。25年以上にわたり、ヒト細胞およびCHO細胞由来の組換えタンパク質を含む、多様な生物種やサンプルタイプにおける核酸シークエンシングの豊富な経験と実績を基盤としております。
専門家にご相談ください
配列サービスには以下が含まれます：
- ハイスループット配列
- 遺伝子およびゲノム領域の再配列
- シングル/マルチプルリード配列
- プライマー設計
- PCR増幅および／または精製
サザンブロット法
サザンブロット法は、DNAを分析する最も古い手法の一つであり、生成された断片のサイズに基づいてゲル電気泳動により分離されたDNAサンプルの消化物を提供します。その後、核酸プローブを用いて特定のDNA標的領域を同定します。
サザンブロット法は、製造細胞のDNA消化産物中にトランスジーンが存在するか否かを検出します。製造細胞株内にトランスジーンが複数コピー存在する場合には、ゲノム上に分散した各標的配列を個別に識別するか、あるいは複数の挿入配列が隣接して位置する場合、より強いバンドの収量を収量します。
これにより、サザンブロットはトランスジーンのコピー数に関するおおよその情報を明らかにすることが可能となり、マスターセルバンクおよび製造終了時セルバンクのサンプルを同一ブロット上で比較し、類似性を実証することができます。
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遺伝子コピー数
トランスジーンのコピー数を特定することは、CHO細胞をはじめとする組換えタンパク質生産に使用される細胞株において、生産性の重要な安定性インジケーターとされています。
生産性を一定に維持する細胞株はトランスジーンコピー数が安定している一方、生産性の低下を示す細胞株では継代に伴いコピー数の変動が認められます。クローンごとのコピー数を測定するには定量PCRが最適な手法です。ザルトリウス社では、アッセイ設計・バリデーションからサンプル適格性確認まで包括的なサービスを提供しております。
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