レトロウイルス
レトロウイルス検査のご要望にお応えします
レトロウイルスは、極めて複雑なライフサイクルを持つウイルス群です。多くの製造細胞株において、プロウイルスとして内因性の形態で存在することが多いため、特に懸念されています。例えばCHO細胞には、透過型電子顕微鏡（TEM）で観察可能なウイルス異物を生成する内在性ウイルスが存在します。これは非感染性ですが、NS0などの一部のマウス細胞株では感染性レトロウイルスが生成されます。
医薬品技術要件の国際調和に関する国際会議（ICH）ガイドライン（3.2.1セクション）では、製造プロセスの3段階（マスター細胞バンク（MCB）、生産終了時（EOP）セルバンク、バルクハーベスト）に適用されるレトロウイルス検査について規定しています。ガイドラインに記載されている試験には、感受性培養における感染性アッセイおよびTEM検査が含まれます。感染性レトロウイルスが検出されず、かつTEM検査でレトロウイルスまたはレトロウイルス様異物が観察されなかった場合にのみ、追加試験が必要となります。この場合、レトロウイルス逆転写酵素の検出アッセイを実施すべきです。
弊社の専門家が、お客様の医薬品開発または市販製品のニーズに合わせてレトロウイルス検査計画を設計いたします。
すぐに使用可能な品質保証済みの試験計画と事前検証済みの現行GMP試験により、専門的な試験への即時アクセスと迅速な結果取得が可能となります。
当社の専門家は、内因性レトロウイルスを含むことが知られている細胞株からの結果を解釈し、製品出荷や規制当局への申請に向けた道筋をご提供いたします。
当社の現行GMP準拠アッセイは、欧州薬局方（EP）および米国薬局方（USP）のガイドラインに準拠しております。
製品の製造に使用される細胞株の種類により、試験の推奨事項は異なります。内因性レトロウイルスを含有していないことが確認されている細胞株（ヒトまたは霊長類由来細胞株）については、通常、透過型電子顕微鏡（TEM）検査および製品増強逆転写酵素（PERT）試験で陰性結果を示す必要があります。内因性レトロウイルスを含むことが知られている細胞株（ハムスター細胞株）については、TEM検査で陽性結果を示し、細胞ベースの感染性試験で陰性結果を示す必要があります。試験の推奨事項は、製品の用途（例：組換えタンパク質生産、ワクチン生産、ウイルス性ワクチン、ウイルスベクター遺伝子治療）によっても異なります。
ウイルス様粒子（VLP）が存在する場合もありますが、非感染性であることが証明されなければなりません。
サンプリング元 | 透過型電子顕微鏡（ | 製品増強型 | 拡張S+Lアッセイ |
|---|---|---|---|
研究用セルバンク | - | - | - |
マスターセルバンク | X | X | X* |
ワーキングセルバンク | - | - | X* |
製造終了セルバンク | X | X | X* |
マスターウイルス種子株 | X | X | - |
作業用ウイルス種子株 | - | X | - |
未精製バルクハーベスト | X | X | X* |
原薬 | - | - | - |
医薬品 | - | - | - |
X* – マウス由来細胞株のみ（例：ハムスター）
200個の細胞プロファイルの検査
本試験は主に哺乳類細胞セルバンク向けに実施され、少なくとも200個の中央細胞プロファイル（核を有する細胞）をTEM（透過型電子顕微鏡）でスクリーニングします。細胞の主要部品——細胞核、細胞小器官、ゴルジ体、および細胞膜——を詳細に観察します。本アッセイでは、細胞形態が保持されていることを確認します。また、ウイルス、VLP、真菌、酵母、細菌、マイコプラズマの有無を特定し、これらに関連する細胞プロファイルの割合を記録します。特定されたレトロウイルスについては、ウイルス粒子の種類を記録します。本アッセイは製品の定量的・定性的データを提供し、提出用にTEM画像が添付されます。
薄セクション法
主にバルクハーベスト試料の調製に用いられる別の方法として、薄切片電子顕微鏡検査がございます。ダイヤモンドナイフとミクロトームを用いて試験物質の超薄セクションを作成し、酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色いたします。ウイルス粒子はランダムに選択した10個のグリッド領域から計数し、力価を算出いたします。
陰性染色法
陰性染色法は、生物試料の形態や超微細構造を観察する高倍率TEM観察を考慮に入れることができます。浮遊液中の生物試料に直接、電子不透過性染色剤を適用します。染色剤は試料を取り囲み浸透することで、生物材料と背景とのコントラストを生じさせます。試料は基準として既知濃度のラテックスビーズと撹拌され、これにより試料中のVLPの力価を算出することが可能となります。
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逆転写酵素試験
蛍光増強逆転写酵素試験（FPERT）アッセイは、逆転写酵素の活性を測定する高感度な検査法です。逆転写酵素は、RNAからDNAを転写する酵素であり、全てのレトロウイルスに存在します。
qPCRベースの手法であるため、TEM法や細胞ベースの手法よりも迅速に結果を得ることが可能です。
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S+Lアッセイ
拡張S+Lアッセイは、MCB、WCB、またはEoPセルバンクサンプル内における感染性レトロウイルスの存在を判定する限界試験であり、感染性マウスレトロウイルスの検出が必要な場合（主にCHO細胞セルバンクまたはマウス細胞セルバンクの試験）に使用されます。
Mus dunni細胞は、Moloney MLVを除く4種類のマイラー白血病ウイルス（MLV）すべてに対するインフェクションをサポートします。MiCl1およびPG4エンドポイント細胞株のいずれかを使用することで、本アッセイは多様な異種感染性および両種感染性感染性マウスレトロウイルスの検出が可能です。
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