微生物コンタミネーション
微生物品質管理製品のご要望にお応えします
バイオ医薬品の製造過程において、汚染微生物は多くの段階でプロセスに侵入する可能性があります。一旦侵入した細菌や真菌は指数関数的に増殖し、最終製品に深刻な影響を及ぼす恐れがあります。さらに、哺乳類細胞を用いた製造では、マイコプラズマやマイコバクテリアによる汚染の可能性が生じます。
ワクチンやその他のバイオ医薬品における微生物の存在は、時間の経過とともに製品に影響を与えるだけでなく、患者様に対する重大なリスクをもたらす可能性があります。そのため、米国食品医薬品局（FDA）や欧州医薬品庁（EMA）を含む規制当局は、コンタミネーションが発生していないことを確認するための厳格な試験を定めています。これは、バッチの代表サンプルに対する微生物品質管理製品を通じて、原料内に生存可能な微生物が存在するか否かを特定することで判断されます。製品が微生物によるコンタミネーションを含まないことの証明は、バイオ医薬品の出荷に必要な情報管理の一部です。
ザルトリウス社では、お客様の微生物汚染試験要件を網羅する包括的な微生物学的安全性試験パッケージを提供しております。これには以下が含まれます：
- 直接播種法による無菌性試験
- 非無菌性の製品によるプレート法による微生物数測定
- マイコプラズマ培養アッセイ
- PCR法によるマイコプラズマ検出
- マイコバクテリウム属菌の検出
Pyros® Kinetix® Flexを用いたエンドトキシン検出
弊社の専門家が、お客様の医薬品開発または市販製品のニーズに合わせて、微生物品質管理製品の試験計画を設計いたします。
すぐに使用可能な、品質が保証された微生物試験法により、お客様の製品マトリックスのアッセイにおける適格性確認または検証が可能となり、試験期間を短縮いたします。
PCRベースの手法により製造工程を迅速化いたします。併せて、薬事規格試験を実施し、お客様の医薬品開発または商業ロットの出荷要件を満たします。
微生物品質管理製品戦略の作成
サンプリング元 | 無菌試験 | 微生物計数試験 | マイコプラズマ試験（規格書記載） | PCR法によるマイコプラズマ試験 | マイコバクテリウム試験 | エンドトキシン試験 |
|---|---|---|---|---|---|---|
研究用セルバンク | X | - | - | X | X* | - |
マスターセルバンク | X | - | X | - | X* | - |
ワーキングセルバンク | X | - | X | - | X* | - |
生産終了セルバンク | X | - | X | - | X* | - |
マスターウイルス種子株 | X | - | X | (X) | X* | - |
作業用ウイルス種子株 | X | - | X | (X) | X* | - |
未精製の大量ハーベスト | - | X | X | (X) | X* | - |
原薬 | X | - | - | - | - | - |
医薬品 | X | - | - | - | - | X |
X* マイコバクテリウム検査は、ヒトまたは霊長類の細胞株、およびそれら由来の製品に対してのみ必要となります。
(X) サンプルウイルスを不活化できない場合には、マイコプラズマ試験に対するその他のリスクベースのアプローチを採用することが可能です。この点につきましては、規制当局とご相談ください。
無菌試験
生物学的製剤またはウイルス性ワクチンの製造プロセス全体において、無菌試験を実施し、その有効性を実証しなければなりません。
ザルトリウス社では、直接播種法およびメンブレンろ過法による無菌試験を、GMP規制および欧州薬局方（EP）、日本薬局方（JP）、米国薬局方（USP）の基準に準拠して提供しております。
試験実施前には、サンプルマトリックスがアッセイにおいて適格であることを確認し、阻害効果の有無を検証する必要があります。これには、試験材料に代表的な試験微生物を低濃縮で添加し、許容範囲内の増殖が確認されることを観察することで達成されます。
以下の微生物はモデル生物として適しています：
好気性細菌
- 黄色ブドウ球菌
- 枯草菌
- 緑膿菌
嫌気性細菌
- クロストリジウム・スポロゲネス
真菌
- カンジダ・アルビカンス
- アスペルギルス・ブラジリエンシス
直接無菌試験では、検体を二種類の培地（チオグリコール酸液体培地および大豆カゼイン消化培地）に播種します。メンブレンろ過試験では、サンプルを0.45 µmフィルターでろ過し、その後トリプチケースソイブロス（TSB）培地およびチオグリコール酸液体培地に播種します。いずれの方法においても、試験は14日間培養されます。ザルトリウスは、最終観察から5日以内に分析証明書付きでアッセイ結果をご報告いたします。
なお、これらの無菌試験は、無菌を意図していない物品には適用されません。その場合はバイオバーデン試験をご利用ください。
ザルトリウスでは、お客様の材料に適した試験方法、ならびにサンプル数および容量についてアドバイザーいたします。
専門家にご相談ください
微生物の計数
バイオバーデン試験の目的は、好気性条件下で増殖する可能性のある中温性細菌および真菌を定量することです。この試験は主に、物質または調製物が微生物学的品質に関する既定の規格に適合しているかどうかを判定するために設計されています。無菌試験と類似していますが、サンプルがさらにプロセスされるため無菌である必要がない場合に実施されます。したがって、この試験は一般的に、お客様が内部プロセス向けに許容可能なバイオバーデン限界値を設定している原材料や中間工程サンプル（例えばバルクハーベスト）に対して使用されます。（無菌性が期待されるバルクハーベストサンプルに対しては無菌試験を実施することも可能です。バイオバーデン試験と無菌試験のどちらを使用するかは開発者の判断に委ねられます。）
バイオバーデン試験には、プレート法と膜ろ過法の2つの方法が利用可能です。いずれも規制当局に認められており、開発者の判断で使用できます。プレート法は、大量のサンプルのプロセッシングに一般的に用いられます。抗生物質などによる特定の阻害効果が認められる場合は、膜ろ過法が使用されることがあります。
プレート法では、試験材料をバッファー水で10倍に希釈した後、所定の容量を2x TSAプレートおよび2x SDAプレートに塗布します。これらを培養し、平均CFU/mLを記録します。
ザルトリウスでは、お客様の材料に適した試験および試験方法についてアドバイザーとしてご提案いたします。
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マイコプラズマ検査
臨床試験用およびヒト用承認製品として製造されるバイオ医薬品において、リアルタイムPCRキットによるマイコプラズマの検出と除去は極めて重要です。マイコプラズマは微生物の一種であり、その増殖には多様かつしばしば厳密な条件を必要とするため、検査は複雑です。ザルトリウス社では、現行GMP基準および現行のICH（医薬品規制調和国際会議）、欧州薬局方（EP）、米国薬局方（USP）のガイドラインに準拠したマイコプラズマ検査サービスを提供しております。
欧州薬局方（EP）に記載されているマイコプラズマ検査には、従来から2つのコンポーネントがあります。寒天培地法とブロス法、そしてインビトロ指標細胞培養法です。検査対象となるサンプルマトリックスは、検査前にアッセイで適格性確認する必要があります。適格性確認には、検査材料に低濃度の試験生物を添加し、検出が可能であることを実証することが含まれます。
試験菌として適しているのは以下の微生物です：
- A. laidlawii
- M. gallisepticum
- M. fermentans
- M. hyorhinis
- M. orale
- マイコバクテリウム・ニューモニアエ
寒天培地と肉汁培地
寒天培地および液体培地法では、検体を異なる液体培地および固体培地に播種し、その後、異なる環境条件（好気性および嫌気性）で培養します。培養期間中、播種済み液体培地から検体を採取し、寒天培地にも播種します。コロニーが検出された場合、陽性反応を示します。試験全体は28日間継続します。
インビトロインジケーター細胞培養法
in vitroインジケーター細胞培養法では、検体を適切な細胞基質（マウス 3T3 細胞またはVero細胞）に播種し、培養した後、DNA に結合する蛍光色素で染色します。培養物を光学顕微鏡で観察し、インジケーター細胞の核周囲に蛍光スポットまたは顆粒が認められる場合、マイコプラズマの存在を示します。ザルトリウス社では、最終観察から5日以内に解析証明書付きでアッセイ結果をご報告いたします。
迅速マイコプラズマポリメラーゼ連鎖反応（PCR）
寒天培地法およびブロス法に加え、欧州薬局方（EP）は適切なバリデーションを経て、PCRベースのマイコプラズマ検査を新たに承認いたしました。欧州薬局方（EP）は、2012年よりバイオ医薬品製品の出荷承認にPCRベースのマイコプラズマ検出法の使用を認めている米国食品医薬品局（FDA）に追随する形となります。本検査により、製造業者は最大28日間を要する既存の方法を迅速な技術に置き換えることが可能となります。マイコプラズマPCR検査はザルトリウス社にて実施可能で、検体受領から48時間以内に結果をご報告いたします。
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マイコバクテリウム検査
本アッセイは、マイコバクテリウム属菌に 感受性のあるヒトまたは霊長類の細胞株を検査する際に実施されます。
検体は、2種類の選択性寒天培地および1種類のブロス培地に播種されます。培地は36～38℃で56日間培養され、マイコバクテリウムの存在が観察されます。
試験の妥当性を確認するため、陽性対照である 結核菌（Mycobacterium tuberculosis）を用いて試験物質を添加した添加対照を含めます。これにより、マイコバクテリアの増殖抑制を評価します。
本法は欧州薬局方セクション2.6.2に準拠しております。
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エンドトキシン試験
エンドトキシン試験は通常、最終医薬品のみに対して実施されます。エンドトキシンはグラム陰性菌の細胞壁外膜を構成する成分であり、バイオ医薬品の製造過程において細胞培養をコンタミネーションする可能性や、最終治療製品をコンタミネーションする可能性があります。
濁度測定法では、大西洋産カブトガニの血液細胞（アメーボサイト）から抽出した水溶液であるリムルスアメーボサイト溶解物（LAL）を、液体試料または標準エンドトキシン希釈液に添加します。その後、反応混合液の濁度を測定します。エンドトキシン濃度が高いほど凝固酵素がより速く有効化されるため、サンプルの濁度は増大します。カイネティックアッセイとして、各サンプルが特定のオプティカル吸光度（OD）に達するまでの時間が重要な測定値となります。
Pyros® Kinetix® Flex および Pyros® eXpress ソフトウェアは、濁度測定によるカイネティック解析の実施がバリデートされています。サンプルの開始時間は標準曲線に対して参照され、サンプル中のエンドトキシン濃度が定量されます。
ザルトリウス社で実施されるカイネティックエンドトキシンアッセイは、調和されたUSP<85>細菌エンドトキシンおよびEP 2.6.14 細菌エンドトキシンに準拠しております。
規制に基づき、新規サンプルマトリックスを試験する前に、阻害および増強に関するサンプルマトリックスの適格性確認が必要となります。
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