物理化学的プロパティ
タンパク質ベースの治療薬はライブセル内で生産されるため、固有の異質性が生じます。モノクローナル抗体の開発においては、この固有の構造的異質性の特性解析が不可欠です。高分子量・低分子量種、電荷変異体、翻訳後修飾はいずれも生体内安定性に影響を与え、生物学的活性の喪失や望ましくない免疫反応を引き起こす可能性があります。
治療用タンパク質の開発プロセスにおける適切な段階で、タンパク質構造の確認および物理化学的解析を実施することにより、ザルトリウスのチームはこれらのリスクを効果的に管理するお手伝いをいたします。
ザルトリウスは、タンパク質構造、糖鎖プロファイル、翻訳後修飾、不純物の特性解析および確認のための包括的な手法を提供しております。当社は最先端技術を活用し、ICH Q6B科学ガイドラインの遵守を確保することで、効率的で合理化された開発プロセスを実現いたします。
主要な物理化学的特性の高分離能直交解析によるタンパク質特性解析の高度化
完全な質量解析は、アイデンティティーに関する予備的な保証を提供するだけでなく、二次構造や翻訳後修飾に関する情報を得ることができます。
構造的および物理化学的特性解析と複雑な生物学的解析を組み合わせることで、お客様のタンパク質を徹底的に理解することが可能となります。
標準的な分子（例えばIgGなど）については、事前認定済みのアッセイをすぐに使用可能の状態でご用意しております。
ICH Q6B 要件 | 当社のソリューション |
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分子量およびサイズ解析 |
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アイソフォームパターン |
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消光係数 | タンパク質濃縮解析 |
電気泳動パターン |
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液体クロマトグラフィーパターン |
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分光プロファイル |
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分子量とサイズ
分子量の測定は、組換え産物が期待通りに合成されているか否かの予備的な確認に不可欠です。分子量測定は潜在的な配列変異を示唆し、糖鎖修飾を含む翻訳後修飾の高水準な評価を提供します。当社の高分離能LC-MS法は正確な分子量情報を提供し、サイズ排除クロマトグラフィー法およびキャピラリー電気泳動SDS法と相補的な役割を果たします。
当社の専任かつ経験豊富なチームは、完全なタンパク質、脱糖化タンパク質、還元タンパク質の質量を評価する手法を有しております。
完全質量解析とは、タンパク質の分子量を決定するプロセスです。観測された質量と一次配列から予測される質量を比較することで、アミノ酸組成に関する予備的な保証が得られます。完全質量解析はまた、主要なタンパク質糖鎖修飾体の性質やその他の主要な修飾に関する情報も提供します。
LC/MSによる解析前にIgGの脱糖化処理を行うことで、N-グリコシル化に伴う不均一性が除去されます。これにより、糖鎖が接着していない状態でのタンパク質骨格の質量を評価することが可能です。この手法は、完全質量データと併せて、一次構造の間の接点のないバリデーションを提供します。
還元モノクローナル抗体のLC/MS解析は、軽鎖および重鎖の個々の分子量を確認するために用いられます。完全体および脱糖化体の質量データを確認するだけでなく、より小さなタンパク質断片の解析により、この手法はより低濃度の修飾に対して感度が高くなります。
当チームでは、CE-SDSおよびSECを用いたサイズ変異体の補完的解析も提供可能です。これらの技術は、分子量およびサイズアイソフォームの評価に対する直交的なアプローチを提供します。
キャピラリー電気泳動（CE）は、その自動化、定量性、スピード、高効率性により、手動スラブゲル電気泳動に代わる効果的な手法となっております。ザルトリウスのCE-SDS技術は、お客様のタンパク質サイズのバリアントに関する情報を提供いたします。
サイズ排除クロマトグラフィーは、低分散・高分離能のクロマトグラフィー手法を用い、モノクローナル抗体の高分子量および低分子量変異体を同定するとともに、結合能および機能活性への影響を評価します。また、ICH Q6bで要求されるアイデンティティー、均質性、純度に関するクロマトグラフィーパターンに関する情報も提供します。
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液体クロマトグラフィーパターン
タンパク質の凝集および分解生成物、ならびに電荷変異体の不均一性は、治療用モノクローナル抗体の安定性、生物学的活性、および免疫原性に関与する基本的な特性です。これらの特性は、クローン細胞株の性質、製造工程、あるいは薬剤の安定性を示す可能性があり、これらは生物学的製剤の開発サイクル全体を通じて必要とされる情報です。
サイズ排除クロマトグラフィーは、低分散・高分離能のクロマトグラフィー手法を用い、モノクローナル抗体の高分子量および低分子量変異体を同定するとともに、結合能および機能活性への影響を評価します。また、クロマトグラフィーパターンに関する情報を提供し、これはICH Q6bで要求されるアイデンティティー、均質性、純度に関する要件を満たすために必要です。
クロマトグラフィー法を用いることで、等電点（pI）に基づくタンパク質総正味電荷に応じて分離することが可能です。イオン交換クロマトグラフィー（IEX）は、正味電荷にわずかな差異がある分子を区別する強力な技術です。いくつかのアミノ酸側鎖が両性を持つプロパティにより、この手法は生体分子の不均一性を理解する上で基礎的な役割を果たします。
逆相（RP）クロマトグラフィーの実施は、製品純度に関する重要な情報を明らかにすることで、モノクローナル抗体の特性解析をサポートします。分離は疎水性に基づいて行われるため、RPクロマトグラフィーはサイズ排除クロマトグラフィーやイオン交換クロマトグラフィーなどの他の技術とは直交する選択性を提供します。これは、異なるジスルフィド結合構造によって構造的に異なる形態を持つ可能性のあるIgG2sにとって特に重要です。
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電気泳動パターン
タンパク質の凝集および分解生成物、ならびに電荷変異体の不均一性は、治療用モノクローナル抗体の安定性、生物学的活性、および免疫原性に関与する基本的な特性です。これらの特性は、クローン細胞株の性質、製造工程、あるいは薬剤の安定性を示す可能性があり、生物学的開発サイクル全体を通じて必要とされる情報となります。
NISTモノクローナル抗体標準品における電気泳動図の例
キャピラリー電気泳動（CE）は、その自動化、定量性、スピード、および高い効率性により、手動のスラブゲル電気泳動に代わる効果的な手法となっております。ザルトリウスのCE-SDS技術は、タンパク質のサイズ変異体に関する情報を提供します。
キャピラリー等電点焦点化（cIEF）は、等電点（pI）に基づいて電荷変異体を分離する二工程技術です。pI値は、既知のpI値を持つタンパク質標準品を用いて決定できます。cIEFはIEXと組み合わせて実施される直交技術であり、SCIEX 800システムで実行されます。
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電荷変異解析
バイオ医薬品の電荷変異体は、安定性や機能に影響を及ぼす可能性があります。電荷の不均一性は、配列変異（例：C末端リシンクリッピング）、化学的分解生成物（例：デアミデーション）、および一部の翻訳後修飾（例：シアル酸を含む糖鎖）によって引き起こされることがあります。この変動性は、宿主細胞株に固有の特性である場合もあれば、商業生産方法によって導入される場合もあります。この不均一性を理解し管理することは、ICH Q6bの要件に内在するものです。
クロマトグラフィー法を用いることで、等電点（pI）に基づくタンパク質の総正負電荷に応じて分離することが可能です。イオン交換クロマトグラフィー（IEX）は、正負電荷にわずかな差異がある分子を区別する強力な技術です。いくつかのアミノ酸側鎖が両性を持つプロパティにより、この手法はバイオ医薬品の異質性を理解する上で基礎的な役割を果たします。
キャピラリー等電点焦点化 （cIEF）は、電荷変異体を等電点（pI）に基づいて分離する二工程の手法です。pI値は既知のpI値を持つタンパク質標準品を用いて決定できます。cIEFは等電点焦点化（IEX）と直交する技術であり、SCIEX 800システムを用いて実施されます。
IgG2アイソフォームの逆相LC/MSプロファイル
逆相液体クロマトグラフィー（LC）と高分解能質量分析（MS）を組み合わせた手法は、モノクローナル抗体治療薬のプロファイルにおいて強力な分析アプローチです。高性能なセパレーションと正確な質量情報の組み合わせにより、抗体の不均一性や安定性に関する詳細な見識を得ることが可能です。しかしながら、これまで完全タンパク質の最高分解能クロマトグラフィー分離にはイオン結合法試薬が依存しており、これがMS感度を損なう可能性がありました。
IgG2抗体の特性解析を促進するため、ザルトリウス社は高分離能の完全タンパク質分離と高感度MSを組み合わせた手法を開発いたしました。カラム技術の近年の進化した進歩を活用し、この手法により異なるIgG2アイソフォームの優れたセパレーションが達成され、さらに複数の追加種が検出されました。加えて、新規イオン結合法試薬の使用によりMS感度が向上し、各種について高品質な質量スペクトルを取得することが可能となりました。
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NISTモノクローナル抗体標準品における電気泳動図の例
分光光度法は、この解析において-well確立された手法です。特定の波長の光をサンプルに通し、吸収度を測定します。このプロセスで一般的に使用される波長は280nmであり、これは芳香族アミノ酸が紫外スペクトルのこの領域で強い吸収を示すためです。このため、しばしばA280分析と呼ばれます。吸光度は、ビール・ランベルトの法則を用いて濃度と関連付けられます：
A = εCL
ここで、A = 吸光度、ε = 消光係数、C = 濃度、L = 光路長です。
固定光路長分光光度計を使用する場合、試料の濃度を装置の直線範囲内に収めるために、慎重な希釈が必要となることがよくあります。これは時間がかかる作業であり、希釈に伴うエラーは、試料の最終的な濃縮計算にエラーをもたらすことになります。
これらの問題に対するソリューションとして、ビール・ランベルトの法則における光路長コンポーネントを変更する可変光路長装置の使用が挙げられます。濃縮ではなく光路長を変更するため、通常は希釈が不要となります。ザルトリウス社が開発したこのアッセイは、正確かつ精密です。固定光路長分光光度計と比較して、短時間で多数のサンプルを解析することが可能です。さらに、解析後のサンプルを回収できる点も利点であり、特に少量のサンプルしか利用できず、複数の異なる試験が必要な場合に有用です。
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